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在金膜之上，NTA芯片的羧基化葡聚糖表面上修飾了NTA（次氮基三乙酸），NTA加Ni2+賦予其“捕獲”功能，而未完全修飾的羧基基團(tuán)則賦予其“偶聯(lián)”的功能。使用“捕獲”功能，可以得到特異性、可逆的捕獲芯片，而同時(shí)使用“捕獲”+“偶聯(lián)”，就可以牢固地偶聯(lián)His標(biāo)簽配體蛋白，且不需低pH緩沖液稀釋。一張芯片，“雙重”身份。
捕獲：
NTA可通過螯合Ni2+，特異性捕獲His標(biāo)簽蛋白，進(jìn)一步檢測此His標(biāo)簽蛋白與其他分子（無His標(biāo)簽）的動力學(xué)/親和力檢測等實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)可逆捕獲檢測實(shí)驗(yàn)。
圖1：使用NTA芯片捕獲法檢測His標(biāo)簽配體-分析物
Biacore提供成熟的NTA芯片及配套試劑盒，包含了實(shí)驗(yàn)中會用到的螯合及再生試劑。控制軟件中選擇Kinetics/affinity using Sensor Chip NTA（Insight software of 1 series and 8 series & Control software of S200，X100及T200在Kinetics/affinity-芯片類型選擇NTA即可）即可開展實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)流程包括：
1
General：芯片表面螯合Ni2+；
2
Capture：捕獲His標(biāo)簽配體 (Ligand in running buffer) ；
3
Analyte：進(jìn)樣分析物，檢測與配體的結(jié)合和解離過程。單循環(huán)實(shí)驗(yàn)中，可以在此步設(shè)置中一個循環(huán)設(shè)置多個濃度，直接得到濃度梯度的結(jié)果；
4
Regeneration：用EDTA洗去Ni2+及配體。
整個循環(huán)結(jié)束后，芯片回歸到初始狀態(tài)，可以用于其他His標(biāo)簽配體的檢測。需要注意的是，分析物不可以有His標(biāo)簽，否則會直接結(jié)合在Ni2+上，影響檢測結(jié)果。
熟悉His標(biāo)簽的老師可能會問：必須用EDTA再生么？當(dāng)然不是。Kong et al. 使用NTA捕獲法檢測14–3-3ζ蛋白與化合物的結(jié)合時(shí)，化合物與靶點(diǎn)蛋白可以完全自發(fā)解離（快解離），因此不設(shè)置再生[1]；Lu et al. 使用NTA捕獲法檢測膜蛋白A2AR與化合物的結(jié)合，使用5 mM theophylline再生洗掉分析物而保留配體[2]。
捕獲+偶聯(lián)：
今年Cell雜志上發(fā)表的以Clp蛋白酶為靶點(diǎn)的新型抗結(jié)核病BacPROTACs研究成果，就是使用NTA芯片說明書中的Capture & Coupling的方法，檢測ClpC3與天然抗生素或HBPs (Homo BacPROTACs) 的結(jié)合[3]。
圖2：NTA芯片Capture & Coupling后，單循環(huán)檢測ClpC3與藥物的親和力
“捕獲”+“偶聯(lián)”可使His標(biāo)簽配體蛋白穩(wěn)定地共價(jià)結(jié)合在芯片。區(qū)別于CM系列芯片，NTA芯片并不通過靜電吸附達(dá)到富集的目的，而是利用Ni2+與His標(biāo)簽的特異性結(jié)合，所以配體分子不需要使用低pH的醋酸鈉緩沖液，用運(yùn)行緩沖液稀釋即可。
在Biacore控制軟件中選擇Immobilization-芯片類型選擇NTA-add step-NTA Amine（Insight software of 1 series and 8 series， X100、T200及S200可在偶聯(lián)方法中自定義偶聯(lián)方法）即可開展實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)流程包括：
1
General：芯片表面螯合Ni2+；
2
Activation：EDC/NHS活化；
3
Capture：捕獲His標(biāo)簽配體 (Ligand in running buffer) ，同時(shí)發(fā)生捕獲和偶聯(lián)。除了設(shè)置配體進(jìn)樣時(shí)間外，Biacore特有的Aim for target level模式，無需緊盯偶聯(lián)信號，不用擔(dān)心偶聯(lián)多了、少了，只需要輸入想要的偶聯(lián)量，儀器自動調(diào)整進(jìn)樣時(shí)間，準(zhǔn)確達(dá)到目標(biāo)偶聯(lián)量。精準(zhǔn)偶聯(lián)So Easy；
4
Deactivation 1：乙醇胺封閉；
5
Deactivation 2：用EDTA洗去Ni2+。
圖3：NTA芯片捕獲+直接偶聯(lián)，target模式下自動完成目標(biāo)偶聯(lián)量
NTA-Amine實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，His標(biāo)簽配體分子被牢牢地偶聯(lián)在芯片上，等同于CM系列芯片的氨基偶聯(lián)。后續(xù)的動力學(xué)/親和力檢測可按照實(shí)驗(yàn)需求，設(shè)置結(jié)合解離及再生步驟，再生并不會洗掉配體。值得注意的是，偶聯(lián)完成后芯片上沒有了Ni2+，所以分析物有無His標(biāo)簽都可檢測。