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轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)之層析如何助力腫瘤免疫？這3篇文獻(xiàn)值得一看
日期：2022-10-10 15:24:43??? 點(diǎn)擊：
免疫治療是二十一世紀(jì)醫(yī)學(xué)的一項(xiàng)重大突破，近年來腫瘤免疫治療發(fā)展空前。
腫瘤免疫在單抗、雙抗、ADC藥物、免疫檢查點(diǎn)抑制劑等藥物開發(fā)，以及CAR-T、TCR-T等基因治療中的相關(guān)研究層出不窮。在研臨床研究數(shù)量超過上千個(gè)，數(shù)量還在不斷增加中。
 
下面我們就來看一下在藥物開發(fā)以及免疫療法的過程中，層析又會(huì)發(fā)揮什么樣的關(guān)鍵作用？
 
黑色素瘤&免疫檢查點(diǎn)抑制劑
 
在過去的十年中，免疫療法極大地改變了腫瘤治療的格局。目前，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）已經(jīng)成為免疫腫瘤學(xué)研究中最熱門的領(lǐng)域之一。免疫檢查點(diǎn)抑制劑就是針對特定的免疫檢查點(diǎn)研發(fā)的一些藥物，來阻斷表達(dá)免疫檢查點(diǎn)的腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的作用。目前展開研究的檢查點(diǎn)通路靶點(diǎn)包括：CTLA-4、PD-1、LAG-3、KIR和OX40等。
2021年1月25日，F(xiàn)DA正式授予特瑞普利單抗(Toripalimab)快速通道資格，用于黏膜黑色素瘤的一線治療。特瑞普利單抗是一款中國自主研發(fā)的針對T細(xì)胞表面PD-1的人源化IgG4的單抗，已經(jīng)獲批在中國市場銷售，并在醫(yī)保談判中被納入醫(yī)保范圍。
    在中科院微生物所聯(lián)合上海君實(shí)這項(xiàng)研究[1]里，首先重組表達(dá)帶有6xHis標(biāo)簽的PD-1，收集上清液后在HisTrap HP鎳離子親和層析柱上粗純，第二步用Superdex 200 10/300 GL分子篩層析柱進(jìn)一步精純得到了PD-1重組蛋白。隨后將特瑞普利單抗酶解消化獲得其Fab抗體片段，用HiTrap Protein A FF親和填料做Fab片段的捕獲，除去酶解過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)。
接下來把純化后的重組PD-1蛋白和特瑞普利單抗Fab片段以1：1混合，冰上孵育30分鐘并用Superdex 200 10/300 GL進(jìn)一步純化。得到的復(fù)合物蛋白晶體收集衍射數(shù)據(jù)，進(jìn)行相互作用機(jī)制的分析后發(fā)現(xiàn)：特瑞普利單抗的HCDR3區(qū)域主要與PD-1的FG環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合，具有多種氫鍵相互作用，可以阻斷 PD-1 與PD-L1，PD-L2之間的相互作用，作為免疫檢查點(diǎn)抑制劑發(fā)揮抗腫瘤功能。
類似以上需要純化蛋白樣品來做結(jié)晶或冷凍電鏡的實(shí)驗(yàn)，制備量通常較少，但純度與回收率要求達(dá)到很高，更加適合使用微量純化設(shè)備ÄKTA pure micro來完成層析步驟，減少稀釋效應(yīng)，提高分辨率。
 
圖1. PD-1及特瑞普利單抗復(fù)合物的層析方法及機(jī)制解析結(jié)果
 
 
胃癌&雙抗
 
疾病往往是復(fù)雜的，尤其是對于腫瘤疾病。而雙抗往往有更精確的靶向性和更好的效果。胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率在世界癌癥發(fā)病率中位居第四位，死亡率居第二位，近二十年來亞洲地區(qū)胃癌發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)了逐年上升趨勢。LewisY抗原是一種在大多數(shù)上皮癌（包括胃癌、卵巢癌等）中高度表達(dá)的聚糖，在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，LewisY已被評估認(rèn)為是治療上皮癌的有效靶點(diǎn)。
上海交通大學(xué)藥學(xué)院聯(lián)合杰科生物于2021年發(fā)表了一篇研究文章[2]，構(gòu)建了以IgG-[L]-scfv格式的靶向LewisY和CD3雙抗(m3s193)。構(gòu)建好的雙抗在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系HEK293F中表達(dá)良好。經(jīng)過一步MabSelect SuRe親和層析純化后，雙抗的產(chǎn)品純度可達(dá)到95%以上，滿足體外和體內(nèi)測定。另外值得一提的是，MabSelect SuRe這款填料可以高效捕獲抗體，且耐堿，可以反復(fù)使用。
隨后的體外結(jié)果顯示制備得到的這種雙抗能激活CD8+T和CD4+T細(xì)胞，促進(jìn)更多的T細(xì)胞浸潤到腫瘤微環(huán)境中，顯著抑制胃癌腫瘤的生長。同時(shí)表現(xiàn)出比親本單抗更好的治療效果，也為胃癌的治療提供了更多基礎(chǔ)研究。
 
圖2. 靶向LewisY和CD3雙抗(m3s193)的層析方法及活性驗(yàn)證
 
利用CRISPR/ Cas12a生成CAR-T細(xì)胞
 
腫瘤免疫相關(guān)的治療藥物除了以上兩個(gè)案例提到的抗體或融合蛋白，嵌合抗原受體(CAR) T細(xì)胞療法的出現(xiàn)也同樣掀起了免疫治療的熱潮。目前臨床多采用病毒的方式將CAR基因?qū)隩細(xì)胞中，基于隨機(jī)整合的原理使得基因整合至T細(xì)胞基因組中，這種方法一定程度上存在轉(zhuǎn)錄沉默、細(xì)胞癌變、異常增殖等風(fēng)險(xiǎn)。而利用基因編輯技術(shù)聯(lián)合同源重組將CAR基因定點(diǎn)整合至T細(xì)胞特定基因座中則提供了一種更為安全的CAR-T細(xì)胞制備方法。
北京大學(xué)最近的一些相關(guān)研究[3-4]就正在嘗試使用基因編輯技術(shù)，在精確的基因組位點(diǎn)中創(chuàng)建CAR-T細(xì)胞。將Cas12a蛋白在2YT培養(yǎng)基中表達(dá)，并用鎳親和柱與高分辨率的Superdex 200 Increase 10/300 GL分子篩層析柱兩步純化。隨后將純化的Cas12a蛋白利用基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)共價(jià)偶連crRNA，形成Cas12a-crRNA共價(jià)復(fù)合物。用電轉(zhuǎn)的方式將Cas12a-crRNA共價(jià)復(fù)合物導(dǎo)入原代T細(xì)胞中，對內(nèi)源性TRAC基因進(jìn)行了定點(diǎn)敲除，隨后通過AAV將CAR基因?qū)隩細(xì)胞中，促使CAR基因定點(diǎn)重組至TRAC基因座中，通過這種方法提供了一種高效制備定點(diǎn)整合CAR-T細(xì)胞的策略，且所制備的 CAR-T細(xì)胞具有良好的抗腫瘤效應(yīng)，為Cas12a的廣泛運(yùn)用及臨床研究奠定了基礎(chǔ)。
 

圖3. Cas12a蛋白的層析方法及基因編輯系統(tǒng)制備CAR-T細(xì)胞的研究思路
 
總結(jié)
 
在腫瘤相關(guān)藥物開發(fā)以及免疫療法的過程中，可見層析發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用。以上是層析在腫瘤免疫學(xué)中的一些應(yīng)用案例分享。目前在該領(lǐng)域常用到的層析柱或填料包括分子篩的Superdex系列和Superose系列；標(biāo)簽蛋白親和層析填料如His標(biāo)簽，Strep標(biāo)簽等親和柱系列；抗體和抗體片段純化常用的Mabselect PrismA系列。此外，精細(xì)純化階段陰、陽離子交換填料如Capto HiRes Q和Capto HiRes S系列等也經(jīng)常使用。
Cytiva作為層析領(lǐng)域的先行者，可以提供從層析填料，到層析設(shè)備，以及層析方案等一系列產(chǎn)品與解決方案。
 

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