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動物細胞來源外泌體生產中的細胞培養(yǎng)工藝
日期：2022-10-10 15:29:48??? 點擊：
細胞外囊泡，尤其是其中的外泌體，正在迅速成為一種新型診斷和治療工具。外泌體是細胞分泌至胞外的納米囊泡，直徑50–150 nm，通過在體內轉運核糖核酸 (RNA)、siRNA、脫氧核糖核酸 (DNA) 和蛋白質等內源性物質，在細胞間通訊中發(fā)揮關鍵作用。外泌體除了直接作為診斷和治療工具外，也可以作為天然衍生的納米遞送系統(tǒng)，遞送外源性小分子、腺相關病毒、siRNA、miRNA 和蛋白質等。與傳統(tǒng)的合成脂質體相比，外泌體具有低免疫原性、低毒性及長半衰期等優(yōu)勢。
 
 
 
目前外泌體生產工藝普遍產量低、回收率或純度低、靶向特異性差，使得外泌體的大規(guī)模生產仍是阻礙其發(fā)展的主要瓶頸之一。外泌體生產包括上游細胞培養(yǎng)工藝，下游分離純化工藝，以及目標產品屬性定義及詳細表征等幾大構成部分。
本文將為大家介紹動物細胞來源外泌體生產中的細胞培養(yǎng)技術和工藝。
外泌體可來源于幾乎所有細胞，目前可通過GMP生產獲得治療性外泌體的主要有五類細胞，包括人心臟祖細胞、骨髓間充質干細胞 (MSCs)、脂肪組織來源的干細胞、樹突狀細胞 (DCs) 和 HEK293 細胞等。外泌體是細胞的分泌產物，因此其生產取決于以不改變細胞表型的方式生產大量細胞的能力。外泌體上游生產中，需依據細胞的特性選擇不同的細胞培養(yǎng)工藝。
 
外泌體生產的主要細胞培養(yǎng)模式
 
一、小規(guī)模靜態(tài)培養(yǎng)
 
產生外泌體的細胞在T型細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等平面容器中靜態(tài)培養(yǎng)，適合貼壁生長的細胞。上述五種常用于外泌體生產的細胞中除經過懸浮馴化的HEK293細胞外，都可采用靜態(tài)培養(yǎng)，優(yōu)點是工藝簡單、易于建立，適合實驗室水平早期研究開發(fā)。
 
二、放大培養(yǎng)
 
對于貼壁依賴細胞，擴大細胞培養(yǎng)規(guī)模主要通過擴大表面積。通過T-Flask、滾瓶、細胞工廠等進行的2D貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)規(guī)模相對有限，較難進行工藝放大。使用中空纖維生物反應器；或在Spinner或攪拌罐生物反應器（SR）中進行貼壁依賴細胞的微載體懸浮培養(yǎng)，可以克服單層貼壁細胞生產外泌體中表面積有限這一最大難題，通過在短時間內產生大量細胞和外泌體來提高效率。
 
1
中空纖維生物反應器
 
優(yōu)勢和特點：
中空纖維生物反應器由半透毛細纖維和圓柱構成，外泌體生產中細胞可位于纖維內部，培養(yǎng)基通過擴散到達細胞，排出細胞代謝物。與動態(tài)生物反應器系統(tǒng)不同，中空纖維生物反應器可以提供與平面 T 型培養(yǎng)瓶等類似的培養(yǎng)模式。而且通過設計和優(yōu)化，可以利用灌流方式將外泌體產物保留在培養(yǎng)室中，獲得更濃縮的條件培養(yǎng)基，進而降低下游的液體處理負擔。目前貼壁HEK293細胞和骨髓間充質干細胞 (BMSC)， 均已實現GMP 條件下在中空纖維生物反應器中生長，并分離出外泌體。
 
挑戰(zhàn)及影響因素：
中空纖維生物反應器可以維持細胞生長，但在培養(yǎng)參數的放大和可控性方面仍具有很大挑戰(zhàn)。外泌體的收獲窗口具有時間限制，細胞在高密度下會發(fā)生接觸抑制及相關的行為變化。有研究發(fā)現，以高密度 (90%) 接種的小鼠脂肪 MSC，在 48 小時內出現與細胞間接觸抑制相關的各種基因的表達改變；而細胞過度融合之前收獲外泌體，則能夠更好地保持各項產品參數。
 
2
攪拌式生物反應器 (SR)
 
搖瓶、Spinner、轉瓶或生物反應器等都可作為動態(tài)培養(yǎng)細胞系統(tǒng)進行外泌體生產。動態(tài)培養(yǎng)可達到的細胞密度因不同的操作模式和培養(yǎng)類型而有所不同，SR主要用于中試和大規(guī)模生產，優(yōu)點是易于放大、培養(yǎng)環(huán)境同質穩(wěn)定、培養(yǎng)參數可控，可在線監(jiān)測。依據細胞的特性，可進行全懸浮SR培養(yǎng)和微載體SR培養(yǎng)。
 
 
a. 懸浮適應細胞培養(yǎng)
SR生物反應器尤其適合懸浮適應細胞的外泌體生產。Margaret Liu等使用無動物來源化學成分明確細胞培養(yǎng)基，采用流加批次方式，成功在 0.5-5L SR 中建立了懸浮適應 HEK293 細胞外泌體生產的細胞培養(yǎng)工藝，同時研究了細胞培養(yǎng)工藝中的主要影響因素：
 
i. 抗結團劑，與其他懸浮適應的細胞系相比，HEK293細胞具有明顯的結團傾向，通過使用抗結團劑糾正細胞的結團現象，可使細胞生長得到明顯改善，VCD 從2.7 增至3.6 × 106 cells mL−1，單細胞外泌體產量從0.46 增至2.7 × 10e6 particles/cell，單位體積產量因此提高了8倍。
 
 
ii. 補料策略，與單純補糖和GlutaMAX的批次培養(yǎng)相比，額外補充 3.5 g/ L的HyClone Cell Boost 補料可將VCD從 3.60增至6.31 × 10e6 cells mL−1，外泌體產量則由7.6 × 10e12 增加至54.7 × 10e12 /L。
 
 
iii. 收獲時機，當收獲時細胞活率從94%分別降至 76% 和48%時，包括外泌體在內的整體細胞外囊泡產量分別由37.0 × 10e12增加至 50.9 he56.5 × 10e12 particles/L，但同時也導致外泌體純度和生物功能下降，因此該工藝采用了80-90%的較高收獲時細胞活率。

 
b. 貼壁細胞的微載體懸浮培養(yǎng)
人間充質干細胞（hMSC ）是常用的外泌體產生細胞，具有貼壁依賴性。在SR中使用微載體懸浮培養(yǎng)，可明顯增加hMSV等貼壁依賴細胞的培養(yǎng)效率及外泌體產量。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，生物反應器可提供更好的過程控制，但在控制反應器內環(huán)境參數的同時，保持細胞和衍生外泌體的表型不發(fā)生改變方面也存在很大挑戰(zhàn)。當細胞從靜態(tài)、平面培養(yǎng)轉移到動態(tài)、需持續(xù)混合的 3D 環(huán)境時，攪拌和通氣引起的剪切應力存在導致細胞水平及其分泌的外泌體表型改變的風險。有報道稱，在轉速為180 rpm生物反應器中培養(yǎng)T 細胞，會引起其白細胞介素 2 受體快速下調，細胞擴增減少。剪切應力可通過誘導MSCs的 p38 絲裂原活化蛋白激酶，和細胞外信號相關激酶的機械轉導途徑，導致其成骨分化，進而改變其外泌體表型。此外，限制高剪切動態(tài)系統(tǒng)中的細胞死亡以最大限度地減少來自凋亡囊泡的雜質至關重要。因為凋亡囊泡的與外泌體大小重疊，可能會增加異質性并降低外泌體產物的效力。
 
 
外泌體生產中的細胞培養(yǎng)基
 
一、含血清培養(yǎng)
 
基礎培養(yǎng)基添加血清是貼壁依賴細胞培養(yǎng)最經典的培養(yǎng)方式，適合各種貼壁細胞的培養(yǎng)，可以最大限度保持細胞及其分泌的外泌體的天然表型。含血清培養(yǎng)用于外泌體生產最大的問題是血清本身含有外泌體，可以通過對血清進行外泌體去除處理減少污染。
 
二、無血清培養(yǎng)
 
除了血清自身的外泌體，從含血清培養(yǎng)基中分離出的外泌體會含有一些源自血清的雜質，可能會進入最終藥物產品，從安全性和監(jiān)管的角度來看是不利的。無血清培養(yǎng)可以很好的解決這些問題，但需要注意的是，無血清培養(yǎng)條件本身對適應含血清培養(yǎng)的細胞就是一種應激，有可能導致細胞的外泌體發(fā)生變化，及凋亡小體增加。有研究發(fā)現，相較含血清培養(yǎng)的神經母細胞瘤細胞系，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)產生的外泌體數量更多，大小或生化性質上沒有差異。但蛋白質組學分析顯示，無血清培養(yǎng)獲得的外泌體含有更多的活性氧和應激相關蛋白。此外也有報道稱源自含血清培養(yǎng)基的外泌體RNA 加工蛋白含量更高。因此無血清培養(yǎng)的前提是維持細胞特征和外泌體產品屬性。需要對無血清應激下產生的外泌體的組成、治療性能和安全性進行徹底研究，排除無血清培養(yǎng)應激引起的外泌體表型改變。
 

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