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作者研究中的片段雙抗是一種串聯(lián)的單鏈可變片段 (scFv) ，它包含了兩個(gè)scFv區(qū)域的融合，并由一個(gè)短肽Linker連接。由于不含F(xiàn)c區(qū)，因此不能用傳統(tǒng)的單抗純化的方法。接下來(lái)看看作者是怎么做的吧！

作者在捕獲階段采用Protein L親和層析，其配基能夠特異性的和抗體輕鏈相互作用結(jié)合。首先，將靶向CD19和CD3的片段雙抗在CHO K1細(xì)胞成功表達(dá)后，離心取上清 (CCS) 。接下來(lái)，用含50 mM HEPES，120 mM NaCl，pH 7.4緩沖液平衡層析柱，將細(xì)胞上清以10 mg單體/mL填料的量進(jìn)行上樣。為了獲得最佳的HCP去除效果和目的物的收率，使用ÄKTA avant內(nèi)置的DoE功能對(duì)洗雜緩沖液中不同鹽濃度和pH條件進(jìn)行篩選，最終選取了513 mM Arg·HCl，87 mM NaCl，pH 6.7的緩沖液。此外，再用含有50 mM HEPES，pH 7.4緩沖液沖洗 5個(gè)CV ，以降低電導(dǎo)值。為了提高雙抗單體與高分子量組分 (HMW) 的分離效果，作者在洗脫緩沖液中加入鹽添加劑，通過(guò)兩步洗脫：

對(duì)于抗體藥而言，僅一步親和層析純化是遠(yuǎn)不夠的，使用多模式復(fù)合填料Capto Adhere能進(jìn)一步去除內(nèi)毒素、DNA、聚集體和HCP等。在繼親和層析對(duì)片段雙抗特異性捕獲之后，采用Capto adhere多模式層析的結(jié)合洗脫模式進(jìn)行精純。用50 mM MES、pH 6.0 緩沖液平衡層析柱，將上一步純化得到的洗脫液調(diào)節(jié)至pH 6.0，稀釋3倍至電導(dǎo)率6-7 mS/cm，然后上柱。在50 mM MES、300 mM、350 mM、400 mM NaCl，pH 6.0緩沖液中依次洗脫。最終在保障回收率的前提下，去除大量的殘留聚集體，將片段雙抗的單體純度從92.3%提高到98.8%，滿足工業(yè)生產(chǎn)需求。

雙抗獨(dú)特的雙靶點(diǎn)結(jié)合能力賦予了新的診療策略。而其表達(dá)情況和結(jié)構(gòu)類型紛繁復(fù)雜，給下游純化工藝帶來(lái)了一定的挑戰(zhàn)。通過(guò)ÄKTA avant內(nèi)置的DoE方法可以大大提高實(shí)驗(yàn)條件篩選的效率，從而更加快速地找到最佳工藝條件。本文的兩步純化工藝（Protein L親和層析+Capto adhere多模式層析），可將HMW和HCP分別降低至<1%和<100 ppm，總收率可達(dá)65%，純度可達(dá)98.8%，證明了兩步法純化片段抗體的潛力。