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因?yàn)榍澳X類器官表現(xiàn)出稀疏的髓鞘形成，缺乏適當(dāng)組織的有髓軸突結(jié)構(gòu)，從而限制了它們在健康和疾病中人類髓鞘生理學(xué)機(jī)制評估中的應(yīng)用。因此體外模擬皮質(zhì)髓鞘發(fā)育特別具有挑戰(zhàn)性。

他們的培養(yǎng)方法參考了以前 Livesey 等人 2016 年發(fā)表的培養(yǎng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的方法^[4]，但是為了生成人類髓鞘形成培養(yǎng)物，他們調(diào)整了上述方案以誘導(dǎo)脊髓圖案的三維類器官中少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟。簡而言之，就是在用 PDGF-AA、IGF-1 和 T3 處理以誘導(dǎo)少突樹發(fā)生之前，將雙重 SMAD 抑制產(chǎn)生的胚狀體暴露于視黃酸 (RA) 和平滑激動(dòng)劑 (SAG) 以分別促進(jìn)尾側(cè)化和腹側(cè)化。為了開始分析髓鞘形成的時(shí)間發(fā)展，類器官在  MI-0、MI-4、MI-8 和 MI-12 處用 CNP 染色, （MI 指髓鞘誘導(dǎo)后第幾周）。具體過程和驗(yàn)證結(jié)果如下圖所示：

圖2.實(shí)驗(yàn)方案時(shí)間點(diǎn)和部分代表性結(jié)果

(A) 生成脊髓圖案類器官的方案示意圖。(B) CNP +少突膠質(zhì)細(xì)胞、NF-H +軸突、SOX10 +少突膠質(zhì)細(xì)胞和 GFAP + MI-0 星形膠質(zhì)細(xì)胞的代表性圖像。(C) CNP +少突膠質(zhì)細(xì)胞、NF-H +軸突、SOX10 +少突膠質(zhì)細(xì)胞和 GFAP + MI-12 星形膠質(zhì)細(xì)胞的代表性圖像。(D) qRT-PCR 衍生的 MI-0 類器官中延髓和尾部基因表達(dá)評估的熱圖。(E) 分別通過 MAP2、NF-H 和 NEUN 對神經(jīng)元樹突、軸突和細(xì)胞體進(jìn)行免疫染色。(F) ChAT +運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的免疫染色。(G) ChAT 和小清蛋白 (PV) 的免疫染色顯示不同神經(jīng)元亞型的分化。

圖3.圖像的定量分析

(A) 用于追蹤每個(gè)細(xì)胞單個(gè)髓鞘的平鋪區(qū)域的代表性圖像。(B) CNP +髓鞘長度的手動(dòng)追蹤。CASPR + PNJ（紅色箭頭）精確重疊手動(dòng)追蹤的髓鞘長度（洋紅色）的遠(yuǎn)端。(C) 每個(gè)細(xì)胞的鞘數(shù)分析。(D) 每個(gè)細(xì)胞的平均鞘長度分析。(E) MI-12 時(shí)髓鞘長度的百分比頻率分布。(F) Ctrl 和 blebbistatin 處理的培養(yǎng)物的單個(gè)細(xì)胞的骨架化 CNP +髓鞘。(G) 與 Ctrl相比，經(jīng) blebbistatin 處理的培養(yǎng)物中每個(gè)細(xì)胞的鞘數(shù)增加了 44.5%。(H) 與 Ctrl 相比，經(jīng)布雷他汀處理的培養(yǎng)物中每個(gè)細(xì)胞的平均鞘長度減少了 24%。(I)自動(dòng)分割 MBP +髓鞘的代表性圖像。(J) 隨著時(shí)間的推移，對歸一化為 NF-H 強(qiáng)度的髓磷脂體積的自動(dòng)分析顯示 MI-4 和 MI-8 之間總體增加了 8 倍。(L) 髓磷脂體積歸一化為 NF-H 強(qiáng)度的自動(dòng)分析顯示經(jīng) BDNF 處理的髓鞘增加了 2.09 倍。(M) NF-H 強(qiáng)度的自動(dòng)分析顯示 Ctrl 和 BDNF 處理的髓鞘樣細(xì)胞之間沒有變化。

圖4. 破傷風(fēng)毒素處理后的圖像的定量分析

(A) 來自 Ctrl 和 TeNT 處理的培養(yǎng)物的單個(gè)細(xì)胞的骨架化 CNP +髓鞘。(B) Ctrl 和 TeNT 處理的髓鞘內(nèi)每個(gè)細(xì)胞的鞘數(shù)。在 TeNT 處理的髓鞘樣細(xì)胞中，每個(gè)細(xì)胞的鞘數(shù)量總體減少了 20%（95% CI：6% 至 31%；p = 0.006）；GLMM，治療為固定效應(yīng)，獨(dú)特的髓鞘 ID 和細(xì)胞系為隨機(jī)效應(yīng)。hPSC1：減少 19%；hPSC2：減少 23%。(C) Ctrl 和 TeNT 處理的髓鞘內(nèi)每個(gè)細(xì)胞的平均鞘長度。在 TeNT 處理的髓鞘樣細(xì)胞中，每個(gè)細(xì)胞的平均鞘長度總體增加了 14%。(D) 最近鄰分析顯示 Ctrl 和 TeNT 處理的髓鞘細(xì)胞之間的少突膠質(zhì)細(xì)胞密度沒有變化。(F) 歸一化為 NF-H 強(qiáng)度的髓鞘體積的自動(dòng)分析表明，TeNT 處理的髓鞘總體基減少了 38%。(G) NF-H 熒光強(qiáng)度的自動(dòng)分析。

圖5. Imagexpress 高內(nèi)涵系統(tǒng)

圖6. Imagexpress 高內(nèi)涵系統(tǒng)Z軸拍攝的設(shè)置

圖7. Imagexpress 高內(nèi)涵系統(tǒng)Z軸拍攝的設(shè)置

A：有代表性的 DAPI, SOX10, CNP 和 NFH 染色的同一個(gè) MI-12  類髓鞘的圖像. B-D：相關(guān)圖像定量數(shù)據(jù)。

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作者成功培養(yǎng)生成了髓鞘類器官即“類髓鞘”，并通過多種方法進(jìn)行了驗(yàn)證。不僅如此，作者還開發(fā)了配套的基于高內(nèi)涵的自動(dòng)化 3D 體積定量方法，并使用破傷風(fēng)毒素對此平臺(tái)做了進(jìn)一步的實(shí)際應(yīng)用和驗(yàn)證，證明其可以作為相關(guān)研究甚至藥物開發(fā)的潛在模型和工具。

通過這篇文章我們可以發(fā)現(xiàn)高內(nèi)涵平臺(tái)在類器官模型應(yīng)用過程中的應(yīng)用逐漸被應(yīng)用于更廣的研究領(lǐng)域，每篇文獻(xiàn)所使用的高內(nèi)涵功能各異，而這篇文獻(xiàn)讓我們了解到 ImageXpress 高內(nèi)涵的自動(dòng)化 3D 類器官體積分析功能的強(qiáng)大和易用性，可以成功分析髓鞘類器官這類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的類器官。

References：